From Wikipedia, the free encyclopedia


Το CRISPR (/ˈkrɪspər/) (ακρωνύμιο των clustered regularly interspaced short palindromic repeats) είναι μια οικογένεια αλληλουχιών DNA που βρίσκονται στα γονιδιώματα προκαρυωτικών οργανισμών, όπως τα βακτήρια και τα αρχαία. [1].Οι αλληλουχίες αυτές προέρχονται από τμήματα DNA βακτηριοφάγων που είχαν προηγουμένως μολύνει τον προκαρυώτη. Χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση και την καταστροφή του DNA από παρόμοιους βακτηριοφάγους κατά τη διάρκεια μεταγενέστερων μολύνσεων. Ως εκ τούτου, οι αλληλουχίες αυτές διαδραματίζουν βασικό ρόλο στο σύστημα αντιικής (δηλαδή αντι-φάγου) άμυνας των προκαρυωτών και παρέχουν μια μορφή επίκτητης ανοσίας. [2] [3] [4] [5]Το CRISPR βρίσκεται περίπου στο 50% των βακτηριακών γονιδιωμάτων που έχουν αλληλουχηθεί και σχεδόν στο 90% των αρχαίων που έχουν αλληλουχηθεί.

Η Cas9 (ή «CRISPR-associated protein 9») είναι ένα ένζυμο που χρησιμοποιεί τις αλληλουχίες CRISPR ως οδηγό για να αναγνωρίζει και να ανοίγει συγκεκριμένες αλυσίδες DNA που είναι συμπληρωματικές προς την αλληλουχία CRISPR. Τα ένζυμα Cas9 μαζί με τις αλληλουχίες CRISPR αποτελούν τη βάση μιας τεχνολογίας γνωστής ως CRISPR-Cas9 που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επεξεργασία γονιδίων μέσα στους οργανισμούς [6] [7]Αυτή η διαδικασία επεξεργασίας έχει μια ευρεία ποικιλία εφαρμογών, συμπεριλαμβανομένης της βασικής βιολογικής έρευνας, της ανάπτυξης βιοτεχνολογικών προϊόντων και της θεραπείας ασθενειών [8] [9]Η ανάπτυξη της τεχνικής επεξεργασίας γονιδιώματος CRISPR-Cas9 αναγνωρίστηκε με το βραβείο Νόμπελ Χημείας το 2020, το οποίο απονεμήθηκε στις Emmanuelle Charpentier και Jennifer Doudna [10] [11]

Ιστορία

Επαναλαμβανόμενες ακολουθίες

Η ανακάλυψη των ομαδοποιημένων επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών DNA πραγματοποιήθηκε ανεξάρτητα σε τρία μέρη του κόσμου. Η πρώτη περιγραφή αυτού που αργότερα θα ονομαζόταν CRISPR προέρχεται από τον ερευνητή του Πανεπιστημίου της Οσάκα Yoshizumi Ishino και τους συναδέλφους του το 1987. Κλωνοποίησαν τυχαία μέρος μιας αλληλουχίας CRISPR μαζί με το γονίδιο «iap» (ισοζυμική μετατροπή της αλκαλικής φωσφατάσης) από το γονιδίωμα της Escherichia coli [12] [13] που ήταν ο στόχος τους. Η οργάνωση των επαναλήψεων ήταν ασυνήθιστη. Οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες τυπικά διατάσσονται διαδοχικά, χωρίς να παρεμβάλλονται διαφορετικές αλληλουχίες [9] [14]. Δεν γνώριζαν τη λειτουργία των διακοπτόμενων ομαδοποιημένων επαναλήψεων.

Το 1993, ερευνητές του Mycobacterium tuberculosis στις Κάτω Χώρες δημοσίευσαν δύο άρθρα σχετικά με μια συστάδα διακοπτόμενων άμεσων επαναλήψεων (DR) στο εν λόγω βακτήριο. Αναγνώρισαν την ποικιλομορφία των αλληλουχιών που παρεμβάλλονταν στις άμεσες επαναλήψεις μεταξύ των διαφόρων στελεχών του M. tuberculosis [15] και χρησιμοποίησαν αυτή την ιδιότητα για να σχεδιάσουν μια μέθοδο τυποποίησης που ονομάστηκε spoligotyping, η οποία χρησιμοποιείται ακόμη και σήμερα [16] [17].

Ο Francisco Mojica του Πανεπιστημίου του Αλικάντε στην Ισπανία μελέτησε τις επαναλήψεις που παρατηρούνται στους οργανισμούς των ειδών Haloferax και Haloarcula και τη λειτουργία τους. Ο επόπτης του Mojica υπέθεσε τότε ότι οι ομαδοποιημένες επαναλήψεις είχαν ρόλο στον σωστό διαχωρισμό του αντιγραμμένου DNA στα θυγατρικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης, επειδή πλασμίδια και χρωμοσώματα με πανομοιότυπες διατάξεις επαναλήψεων δεν μπορούσαν να συνυπάρξουν στον Haloferax volcanii. Για πρώτη φορά παρατηρήθηκε επίσης η μεταγραφή των διακοπτόμενων επαναλήψεων- αυτός ήταν ο πρώτος πλήρης χαρακτηρισμός του CRISPR. [18] [19]Μέχρι το 2000, ο Mojica πραγματοποίησε μια έρευνα στην επιστημονική βιβλιογραφία και ένας από τους φοιτητές του πραγματοποίησε μια αναζήτηση σε δημοσιευμένα γονιδιώματα με ένα πρόγραμμα που επινόησε ο ίδιος. Εντόπισαν διακεκομμένες επαναλήψεις σε 20 είδη μικροβίων που ανήκαν στην ίδια οικογένεια [20]. Επειδή οι αλληλουχίες αυτές ήταν διακεκομμένες, ο Mojica ονόμασε αρχικά τις αλληλουχίες αυτές «σύντομες επαναλήψεις με τακτά διαστήματα» (short regular spaced repeats, SRSR) [21]. Το 2001, ο Mojica και ο Ruud Jansen, οι οποίοι αναζητούσαν μια επιπλέον διακοπτόμενη επανάληψη, πρότειναν το ακρωνύμιο CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) για να αμβλύνουν τη σύγχυση που προέκυπτε από τα πολυάριθμα ακρωνύμια που χρησιμοποιούνταν για την περιγραφή των αλληλουχιών στην επιστημονική βιβλιογραφία [19] [22]. Το 2002, οι Tang, et al. έδειξαν στοιχεία ότι οι επαναλαμβανόμενες περιοχές CRISPR από το γονιδίωμα του Archaeoglobus fulgidus μεταγράφηκαν στα μακρά μόρια RNA που στη συνέχεια επεξεργάστηκαν σε μικρά RNAs μήκους μονάδας, καθώς και σε ορισμένες μεγαλύτερες μορφές 2, 3 ή περισσότερων μονάδων επανάληψης διαστήματος [23] [24].

Το 2005, ο ερευνητής του γιαουρτιού Rodolphe Barrangou ανακάλυψε ότι ο Streptococcus thermophilus, μετά από επαναλαμβανόμενες προκλήσεις φάγων, αναπτύσσει αυξημένη αντοχή στους φάγους και αυτή η αυξημένη αντοχή οφείλεται στην ενσωμάτωση πρόσθετων αλληλουχιών διαστήματος CRISPR [25] Η δανέζικη εταιρεία τροφίμων Danisco, για την οποία εργαζόταν τότε ο Barrangou, ανέπτυξε στη συνέχεια στελέχη S. thermophilus ανθεκτικά στους φάγους για χρήση στην παραγωγή γιαουρτιού. Η Danisco εξαγοράστηκε αργότερα από την DuPont, η οποία «κατέχει περίπου το 50% της παγκόσμιας αγοράς γαλακτοκομικών καλλιεργειών» και η τεχνολογία καθιερώθηκε [26].

Συστήματα που σχετίζονται με το CRISPR

Μια σημαντική προσθήκη στην κατανόηση του CRISPR ήρθε με την παρατήρηση του Jansen ότι το σύμπλεγμα επαναλήψεων των προκαρυωτών συνοδεύεται από ένα σύνολο ομόλογων γονιδίων που αποτελούν τα συστήματα που σχετίζονται με το CRISPR ή τα γονίδια cas. Αρχικά αναγνωρίστηκαν τέσσερα γονίδια cas (cas 1-4). Οι πρωτεΐνες Cas εμφάνιζαν μοτίβα ελικάσης και νουκλεάσης, υποδηλώνοντας έναν ρόλο στη δυναμική δομή των τόπων CRISPR [27].Σε αυτή τη δημοσίευση, το ακρωνύμιο CRISPR χρησιμοποιήθηκε ως η καθολική ονομασία αυτού του μοτίβου. Ωστόσο, η λειτουργία του CRISPR παρέμενε αινιγματική.

Το 2005, τρεις ανεξάρτητες ερευνητικές ομάδες έδειξαν ότι ορισμένοι αποστάτες CRISPR προέρχονται από DNA φάγων και εξωχρωμοσωμικό DNA, όπως πλασμίδια [28] [29] [30].Στην πραγματικότητα, οι αποστάτες είναι θραύσματα DNA που συγκεντρώθηκαν από ιούς που προσπάθησαν προηγουμένως να επιτεθούν στο κύτταρο. Η προέλευση των spacers ήταν ένα σημάδι ότι το σύστημα CRISPR-cas θα μπορούσε να έχει ρόλο στην προσαρμοστική ανοσία στα βακτήρια [31] [32].Και οι τρεις μελέτες που πρότειναν αυτή την ιδέα απορρίφθηκαν αρχικά από περιοδικά υψηλού κύρους, αλλά τελικά εμφανίστηκαν σε άλλα περιοδικά [33].

Η πρώτη δημοσίευση [29] που πρότεινε τον ρόλο του CRISPR-Cas στη μικροβιακή ανοσία, από τον Mojica και τους συνεργάτες του στο Πανεπιστήμιο του Αλικάντε, προέβλεψε έναν ρόλο της μεταγραφής των διαστημάτων RNA στην αναγνώριση των στόχων σε έναν μηχανισμό που θα μπορούσε να είναι ανάλογος με το σύστημα παρεμβολής RNA που χρησιμοποιείται από τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Ο Koonin και οι συνεργάτες του επέκτειναν αυτή την υπόθεση της παρεμβολής RNA προτείνοντας μηχανισμούς δράσης για τους διάφορους υποτύπους CRISPR-Cas σύμφωνα με την προβλεπόμενη λειτουργία των πρωτεϊνών τους [34].

Οι πειραματικές εργασίες διαφόρων ομάδων αποκάλυψαν τους βασικούς μηχανισμούς της ανοσίας CRISPR-Cas. Το 2007 δημοσιεύθηκαν οι πρώτες πειραματικές αποδείξεις ότι το CRISPR ήταν ένα προσαρμοστικό ανοσοποιητικό σύστημα [4] [9]. Μια περιοχή CRISPR στον Streptococcus thermophilus απέκτησε διαστήματα από το DNA ενός βακτηριοφάγου που τον μόλυνε. Οι ερευνητές χειραγώγησαν την ανθεκτικότητα του S. thermophilus σε διαφορετικούς τύπους φάγων προσθέτοντας και διαγράφοντας spacers των οποίων η αλληλουχία ταίριαζε με εκείνες που βρέθηκαν στους εξεταζόμενους φάγους [35] [36]Το 2008, οι Brouns και Van der Oost εντόπισαν ένα σύμπλεγμα πρωτεϊνών Cas (που ονομάζεται Cascade) που στο E. coli έκοψε τον πρόδρομο CRISPR RNA εντός των επαναλήψεων σε ώριμα μόρια RNA που περιείχαν αποστάτες και ονομάζονταν CRISPR RNA (crRNA), τα οποία παρέμεναν συνδεδεμένα με το πρωτεϊνικό σύμπλοκο [37]. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η Cascade, το crRNA και μια ελικάση/νουκλεάση ( Cas3) απαιτούνταν για να παρέχουν σε έναν βακτηριακό ξενιστή ανοσία έναντι μόλυνσης από έναν ιό DNA. Σχεδιάζοντας ένα CRISPR κατά του ιού, απέδειξαν ότι δύο προσανατολισμοί του crRNA (sense/antisense) παρείχαν ανοσία, υποδεικνύοντας ότι οι οδηγοί crRNA στόχευαν dsDNA. Εκείνη τη χρονιά οι Marraffini και Sontheimer επιβεβαίωσαν ότι μια αλληλουχία CRISPR του S. epidermidis στόχευε το DNA και όχι το RNA για να αποτρέψει τη σύζευξη. Αυτό το εύρημα ήταν σε αντίθεση με τον προτεινόμενο μηχανισμό RNA-παρεμβολής της ανοσίας CRISPR-Cas, αν και ένα σύστημα CRISPR-Cas που στοχεύει ξένο RNA βρέθηκε αργότερα στον Pyrococcus furiosus [9] [36]Μια μελέτη του 2010 έδειξε ότι το CRISPR-Cas κόβει και τα δύο σκέλη του DNA του φάγου και του πλασμιδιακού DNA στον S. thermophilus [38].

Cas9

Κύριο άρθρο: Cas9

Ένα απλούστερο σύστημα CRISPR από τον Streptococcus pyogenes βασίζεται στην πρωτεΐνη Cas9. Η ενδονουκλεάση Cas9 είναι ένα σύστημα τεσσάρων συστατικών που περιλαμβάνει δύο μικρά μόρια: το crRNA και το trans-ενεργοποιητικό CRISPR RNA (tracrRNA) [39] [40]. Το 2012, η Jennifer Doudna και η Emmanuelle Charpentier επανασχεδίασαν την ενδονουκλεάση Cas9 σε ένα πιο εύχρηστο σύστημα δύο συστατικών, συγχωνεύοντας τα δύο μόρια RNA σε ένα «single-guide RNA» που, όταν συνδυάζεται με το Cas9, μπορεί να βρει και να κόψει τον στόχο DNA που καθορίζεται από το guide RNA[43] Η συμβολή αυτή ήταν τόσο σημαντική που αναγνωρίστηκε με το βραβείο Νόμπελ Χημείας το 2020. Με τον χειρισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του καθοδηγητικού RNA, το τεχνητό σύστημα Cas9 μπορούσε να προγραμματιστεί ώστε να στοχεύει οποιαδήποτε αλληλουχία DNA για διαχωρισμό [41]. Μια άλλη ομάδα συνεργατών, αποτελούμενη από τον Virginijus Šikšnys μαζί με τους Gasiūnas, Barrangou και Horvath, έδειξε ότι το Cas9 από το σύστημα CRISPR του S. thermophilus μπορεί επίσης να επαναπρογραμματιστεί ώστε να στοχεύει μια περιοχή της επιλογής τους, αλλάζοντας την αλληλουχία του crRNA του. Αυτές οι εξελίξεις τροφοδότησαν τις προσπάθειες για την επεξεργασία γονιδιωμάτων με το τροποποιημένο σύστημα CRISPR-Cas9 [17].

Ομάδες με επικεφαλής τους Feng Zhang και George Church δημοσίευσαν ταυτόχρονα περιγραφές της επεξεργασίας γονιδιώματος σε καλλιέργειες ανθρώπινων κυττάρων με τη χρήση του CRISPR-Cas9 για πρώτη φορά [9] [42] [43].Έκτοτε έχει χρησιμοποιηθεί σε ένα ευρύ φάσμα οργανισμών, συμπεριλαμβανομένης της ζύμης αρτοποιίας ( Saccharomyces cerevisiae) [44] [45] [46], του ευκαιριακού παθογόνου Candida albicans [47] [48], του ψαριού ζέβρα ( Danio rerio) [49], της μύγας των φρούτων ( Drosophila melanogaster) [50] [51], μυρμήγκια ( Harpegnathos saltator [52] και Ooceraea biroi [53]), κουνούπια ( Aedes aegypti [54]), νηματώδεις ( Caenorhabditis elegans) [55],φυτά [56], ποντίκια ( Mus musculus domesticus) [57] [58], πίθηκοι [59] και ανθρώπινα έμβρυα [60].

Το CRISPR έχει τροποποιηθεί ώστε να κατασκευάζει προγραμματιζόμενους μεταγραφικούς παράγοντες που επιτρέπουν τη στόχευση και την ενεργοποίηση ή την αποσιώπηση συγκεκριμένων γονιδίων [61].

Το σύστημα CRISPR-Cas9 έχει δείξει ότι μπορεί να κάνει αποτελεσματικές γονιδιακές επεμβάσεις σε ανθρώπινα τριπύρηνα ζυγωτά που περιγράφηκαν για πρώτη φορά το 2015 σε μια εργασία των Κινέζων επιστημόνων P. Liang και Y. Xu. Το σύστημα πραγματοποίησε επιτυχή διάσπαση της μεταλλαγμένης β-αιμοσφαιρίνης (HBB) σε 28 από τα 54 έμβρυα. Τέσσερα από τα 28 έμβρυα ανασυνδυάστηκαν επιτυχώς χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο δότη που έδωσαν οι επιστήμονες. Οι επιστήμονες έδειξαν ότι κατά τον ανασυνδυασμό του DNA της διασπασμένης αλυσίδας, η ομόλογη ενδογενής αλληλουχία HBD ανταγωνίζεται το εξωγενές πρότυπο δότη. Η επιδιόρθωση του DNA στα ανθρώπινα έμβρυα είναι πολύ πιο περίπλοκη και ιδιαίτερη από ό,τι στα παράγωγα βλαστικά κύτταρα [62].

Cas12a

Κύριο άρθρο: Cas12a

Το 2015, η νουκλεάση Cas12a (παλαιότερα γνωστή ως Cpf1 [63]) χαρακτηρίστηκε στο σύστημα CRISPR-Cpf1 του βακτηρίου Francisella novicida [64] [65].Το αρχικό της όνομα, από έναν ορισμό της οικογένειας πρωτεϊνών TIGRFAMs που κατασκευάστηκε το 2012, αντανακλά την επικράτηση του υποτύπου CRISPR-Cas της στις γενεαλογίες Prevotella και Francisella. Το Cas12a παρουσίασε αρκετές βασικές διαφορές από το Cas9, μεταξύ των οποίων: προκαλεί μια «κλιμακωτή» τομή σε δίκλωνο DNA σε αντίθεση με την «αμβλεία» τομή που παράγει το Cas9, βασίζεται σε ένα «πλούσιο σε Τ» PAM (παρέχοντας εναλλακτικές θέσεις στόχευσης σε σχέση με το Cas9) και απαιτεί μόνο ένα CRISPR RNA (crRNA) για την επιτυχή στόχευση. Αντίθετα, το Cas9 απαιτεί τόσο crRNA όσο και ένα trans-ενεργοποιητικό crRNA (tracrRNA).

Αυτές οι διαφορές ενδέχεται να προσδίδουν στο Cas12a ορισμένα πλεονεκτήματα έναντι του Cas9. Για παράδειγμα, τα μικρά crRNA του Cas12a είναι ιδανικά για πολυπλεξική επεξεργασία γονιδιώματος, καθώς περισσότερα από αυτά μπορούν να συσκευαστούν σε έναν φορέα από ό,τι τα sgRNA του Cas9. Οι κολλώδεις προεξοχές 5′ που αφήνει το Cas12a μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για τη συναρμολόγηση DNA που είναι πολύ πιο συγκεκριμένη για τον στόχο από την παραδοσιακή κλωνοποίηση με ένζυμο περιορισμού [66].Τέλος, το Cas12a κόβει το DNA 18-23 ζεύγη βάσεων κατάντη της θέσης PAM. Αυτό σημαίνει ότι δεν υπάρχει διακοπή της αλληλουχίας αναγνώρισης μετά την επιδιόρθωση και έτσι το Cas12a επιτρέπει πολλαπλούς γύρους διάσπασης του DNA. Αντίθετα, δεδομένου ότι η Cas9 κόβει μόνο 3 ζεύγη βάσεων ανάντη της θέσης PAM, το μονοπάτι NHEJ οδηγεί σε μεταλλάξεις indel που καταστρέφουν την αλληλουχία αναγνώρισης, εμποδίζοντας έτσι περαιτέρω γύρους κοπής. Θεωρητικά, οι επαναλαμβανόμενοι γύροι διάσπασης του DNA θα πρέπει να προκαλούν αυξημένη ευκαιρία για την πραγματοποίηση της επιθυμητής γονιδιωματικής επεξεργασίας [67]. Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της Cas12a, σε σύγκριση με την Cas9, είναι ότι μετά την κοπή του στόχου της, η Cas12a παραμένει συνδεδεμένη με τον στόχο και στη συνέχεια κόβει άλλα μόρια ssDNA χωρίς διάκριση [68]. Αυτή η ιδιότητα ονομάζεται «παράπλευρη δραστηριότητα διάσπασης» ή «trans-cleavage» και έχει αξιοποιηθεί για την ανάπτυξη διαφόρων διαγνωστικών τεχνολογιών [69] [70].

Cas13

Το 2016 χαρακτηρίστηκε η νουκλεάση Cas13a (πρώην γνωστή ως C2c2) από το βακτήριο Leptotrichia shahii. Η Cas13 είναι μια RNA-καθοδηγούμενη RNA-ενδονουκλεάση, πράγμα που σημαίνει ότι δεν κόβει DNA, αλλά μόνο μονόκλωνο RNA. Η Cas13 καθοδηγείται από το crRNA της σε έναν ssRNA-στόχο και δεσμεύει και κόβει τον στόχο. Παρόμοια με την Cas12a, η Cas13 παραμένει συνδεδεμένη στο στόχο και στη συνέχεια κόβει άλλα μόρια ssRNA χωρίς διάκριση [71]. Αυτή η παράπλευρη ιδιότητα διάσπασης έχει αξιοποιηθεί για την ανάπτυξη διαφόρων διαγνωστικών τεχνολογιών [72] [73] [74].

Το 2021, ο Δρ Hui Yang χαρακτήρισε νέες παραλλαγές της πρωτεΐνης Cas13 σε μικρογραφία (mCas13), τις Cas13X και Cas13Y. Χρησιμοποιώντας ένα μικρό τμήμα της αλληλουχίας του γονιδίου N από τον SARS-CoV-2 ως στόχο για τον χαρακτηρισμό της mCas13, αποκάλυψε την ευαισθησία και την ειδικότητα της mCas13 σε συνδυασμό με την RT-LAMP για την ανίχνευση του SARS-CoV-2 τόσο σε συνθετικά όσο και σε κλινικά δείγματα σε σχέση με άλλες διαθέσιμες τυπικές δοκιμασίες όπως η RT-qPCR (1 αντίγραφο/μL) [75].

Δομή

Επαναλήψεις και διαστήματα

Η συστοιχία CRISPR αποτελείται από μια πλούσια σε ΑΤ αρχική αλληλουχία, ακολουθούμενη από σύντομες επαναλήψεις που χωρίζονται από μοναδικά διαστήματα [76].Οι επαναλήψεις CRISPR κυμαίνονται συνήθως σε μέγεθος από 28 έως 37 ζεύγη βάσεων (bps), αν και μπορεί να είναι τόσο λίγες όσο 23 bps και τόσο πολλές όσο 55 bps [77].Ορισμένες παρουσιάζουν συμμετρία δυάδας, υποδηλώνοντας το σχηματισμό μιας δευτερογενούς δομής όπως ένας βρόχος-στέλεχος («φουρκέτα») στο RNA, ενώ άλλες είναι σχεδιασμένες να είναι αδόμητες. Το μέγεθος των διατημάτων στις διάφορες συστοιχίες CRISPR είναι συνήθως 32 έως 38 bp (εύρος 21 έως 72 bp) [77]. Νέα διαστήματα μπορούν να εμφανιστούν γρήγορα ως μέρος της ανοσολογικής απόκρισης στη μόλυνση από φάγο [78] Υπάρχουν συνήθως λιγότερες από 50 μονάδες της αλληλουχίας επανάληψης-διαστήματα σε μια συστοιχία CRISPR [77].

Γονίδια Cas και υπότυποι CRISPR

Μικρές συστάδες γονιδίων cas βρίσκονται συχνά δίπλα σε συστοιχίες επαναλαμβανόμενων διαστημάτων CRISPR. Συλλογικά, τα 93 γονίδια cas ομαδοποιούνται σε 35 οικογένειες με βάση την ομοιότητα αλληλουχίας των πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται. 11 από τις 35 οικογένειες αποτελούν τον πυρήνα cas, ο οποίος περιλαμβάνει τις οικογένειες πρωτεϊνών Cas1 έως Cas9. Ένας πλήρης τόπος CRISPR-Cas έχει τουλάχιστον ένα γονίδιο που ανήκει στον πυρήνα cas [79].

Τα συστήματα CRISPR-Cas διακρίνονται σε δύο κατηγορίες. Τα συστήματα της κατηγορίας 1 χρησιμοποιούν ένα σύμπλεγμα πολλαπλών πρωτεϊνών Cas για την αποικοδόμηση ξένων νουκλεϊκών οξέων. Τα συστήματα της κατηγορίας 2 χρησιμοποιούν μία μόνο μεγάλη πρωτεΐνη Cas για τον ίδιο σκοπό. Η κλάση 1 χωρίζεται σε τύπους I, III και IV- η κλάση 2 χωρίζεται σε τύπους II, V και VI [80].Οι 6 τύποι συστημάτων χωρίζονται σε 19 υπότυπους [81].Κάθε τύπος και οι περισσότεροι υπότυποι χαρακτηρίζονται από ένα «γονίδιο υπογραφής» που απαντάται σχεδόν αποκλειστικά στην κατηγορία. Η ταξινόμηση βασίζεται επίσης στο συμπλήρωμα των γονιδίων cas που είναι παρόντα. Τα περισσότερα συστήματα CRISPR-Cas διαθέτουν μια πρωτεΐνη Cas1. Η φυλογένεση των πρωτεϊνών Cas1 γενικά συμφωνεί με το σύστημα ταξινόμησης [82], αλλά υπάρχουν εξαιρέσεις λόγω της αναδιάταξης των μονάδων [79]. Πολλοί οργανισμοί περιέχουν πολλαπλά συστήματα CRISPR-Cas, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι συμβατά και μπορεί να μοιράζονται συστατικά [83] [84]. Η σποραδική κατανομή των υποτύπων CRISPR-Cas υποδηλώνει ότι το σύστημα CRISPR-Cas υπόκειται σε οριζόντια γονιδιακή μεταφορά κατά τη διάρκεια της μικροβιακής εξέλιξης.

Μηχανισμός

Η ανοσία CRISPR-Cas είναι μια φυσική διαδικασία των βακτηρίων και των αρχαίων [85]. Η CRISPR-Cas αποτρέπει τη μόλυνση από βακτηριοφάγους, τη σύζευξη και το φυσικό μετασχηματισμό, αποικοδομώντας τα ξένα νουκλεϊκά οξέα που εισέρχονται στο κύτταρο [36].

Απόκτηση διαστήματος

Όταν ένας μικροοργανισμός προσβάλλεται από έναν βακτηριοφάγο, το πρώτο στάδιο της ανοσολογικής απόκρισης είναι η σύλληψη του DNA του φάγου και η εισαγωγή του σε έναν τόπο CRISPR με τη μορφή διαστήματος. Οι Cas1 και Cas2 βρίσκονται και στους δύο τύπους ανοσοποιητικών συστημάτων CRISPR-Cas, γεγονός που υποδηλώνει ότι εμπλέκονται στην απόκτηση διαστήματος. Μελέτες μετάλλαξης επιβεβαίωσαν αυτή την υπόθεση, δείχνοντας ότι η αφαίρεση των Cas1 ή Cas2 σταμάτησε την απόκτηση διαστήματος, χωρίς να επηρεάσει την ανοσολογική απόκριση CRISPR [86] [87] [88] [89] [90].

Πολλαπλές πρωτεΐνες Cas1 έχουν χαρακτηριστεί και οι δομές τους έχουν επιλυθεί [91] [92] [93]Οι πρωτεΐνες Cas1 έχουν ποικίλες αλληλουχίες αμινοξέων. Ωστόσο, οι κρυσταλλικές δομές τους είναι παρόμοιες και όλες οι καθαρισμένες πρωτεΐνες Cas1 είναι μεταλλοεξαρτώμενες νουκλεάσες/ενσωματώματα που προσδένονται στο DNA με τρόπο ανεξάρτητο από την αλληλουχία [83].Αντιπροσωπευτικές πρωτεΐνες Cas2 έχουν χαρακτηριστεί και διαθέτουν είτε (μονόκλωνη) ssRNA- [94] είτε (δίκλωνη) dsDNA- [95] [96]ειδική δραστικότητα ενδοριβονουκλεάσης.

Στο σύστημα I-E του E. coli το Cas1 και το Cas2 σχηματίζουν ένα σύμπλοκο όπου ένα διμερές Cas2 γεφυρώνει δύο διμερή Cas1 [97].Σε αυτό το σύμπλοκο το Cas2 επιτελεί έναν μη ενζυμικό ρόλο ικριώματος [97] δεσμεύοντας δίκλωνα θραύσματα του εισβάλλοντος DNA, ενώ το Cas1 δεσμεύει τα μονόκλωνα πλευρικά τμήματα του DNA και καταλύει την ενσωμάτωσή τους στις συστοιχίες CRISPR [98] [99] [100].Οι νέοι αποστάτες προστίθενται συνήθως στην αρχή του CRISPR δίπλα στην αρχηγική αλληλουχία δημιουργώντας ένα χρονολογικό αρχείο των ιικών μολύνσεων [101]. Στην E. coli μια πρωτεΐνη που μοιάζει με ιστόνη και ονομάζεται παράγοντας υποδοχής ενσωμάτωσης (IHF), η οποία συνδέεται με την αλληλουχία ηγέτη, είναι υπεύθυνη για την ακρίβεια αυτής της ενσωμάτωσης [102].Ο IHF ενισχύει επίσης την αποτελεσματικότητα της ενσωμάτωσης στο σύστημα τύπου I-F του Pectobacterium atrosepticum [103], αλλά σε άλλα συστήματα μπορεί να απαιτούνται διαφορετικοί παράγοντες υποδοχής [104]

  1. ^ Barrangou, Rodolphe (February 2015). "The roles of CRISPR-Cas systems in adaptive immunity and beyond". Current Opinion in Immunology. 32: 36–41. doi: 10.1016/j.coi.2014.12.008. ISSN  1879-0372. PMID  25574773.
  2. ^ Barrangou, Rodolphe (February 2015). "The roles of CRISPR–Cas systems in adaptive immunity and beyond". Current Opinion in Immunology. 32: 36–41. doi: 10.1016/j.coi.2014.12.008. PMID  25574773.
  3. ^ Redman, Melody; King, Andrew; Watson, Caroline; King, David (August 2016). "What is CRISPR/Cas9?". Archives of Disease in Childhood - Education & Practice Edition. 101 (4): 213–215. doi: 10.1136/archdischild-2016-310459. ISSN  1743-0585. PMC  4975809. PMID  27059283.
  4. ^ a b Barrangou, Rodolphe; Fremaux, Christophe; Deveau, Hélène; Richards, Melissa; Boyaval, Patrick; Moineau, Sylvain; Romero, Dennis A.; Horvath, Philippe (2007-03-23). "CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes". Science. 315 (5819): 1709–1712. Bibcode: 2007Sci...315.1709B. doi: 10.1126/science.1138140. ISSN  0036-8075. PMID  17379808.
  5. ^ Marraffini, Luciano A.; Sontheimer, Erik J. (2008-12-19). "CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA". Science. 322 (5909): 1843–1845. Bibcode: 2008Sci...322.1843M. doi: 10.1126/science.1165771. ISSN  0036-8075. PMC  2695655. PMID  19095942.
  6. ^ Bak, Rasmus O.; Gomez-Ospina, Natalia; Porteus, Matthew H. (August 2018). "Gene Editing on Center Stage". Trends in Genetics. 34 (8): 600–611. doi: 10.1016/j.tig.2018.05.004. PMID  29908711.
  7. ^ Zhang, F.; Wen, Y.; Guo, X. (2014-09-15). "CRISPR/Cas9 for genome editing: progress, implications and challenges". Human Molecular Genetics. 23 (R1): R40–R46. doi: 10.1093/hmg/ddu125. ISSN  0964-6906. PMID  24651067.
  8. ^ Stephens, J.; Barakate, A. (2017), "Gene Editing Technologies – ZFNs, TALENs, and CRISPR/Cas9", Encyclopedia of Applied Plant Sciences, Elsevier, pp. 157–161, doi: 10.1016/b978-0-12-394807-6.00242-2, ISBN  978-0-12-394808-3, retrieved 2024-05-03
  9. ^ a b c d e Hsu, Patrick D.; Lander, Eric S.; Zhang, Feng (June 2014). "Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering". Cell. 157 (6): 1262–1278. doi: 10.1016/j.cell.2014.05.010. PMC  4343198. PMID  24906146.
  10. ^ Varga, Máté (2021-02-01). "Kémiai Nobel-díj, 2020 • Nobel Prize in Chemistry, 2020". Magyar Tudomány. doi: 10.1556/2065.182.2021.2.8. ISSN  0025-0325.
  11. ^ Miller, Johanna L. (2020-12-01). "Charpentier, Doudna win chemistry Nobel for development of CRISPR-Cas genome editing". Physics Today. 73 (12): 20–23. Bibcode: 2020PhT....73l..20M. doi: 10.1063/pt.3.4630. ISSN  0031-9228.
  12. ^ Rawat, Aadish; Roy, Mrinalini; Jyoti, Anupam; Kaushik, Sanket; Verma, Kuldeep; Srivastava, Vijay Kumar (August 2021). "Cysteine proteases: Battling pathogenic parasitic protozoans with omnipresent enzymes". Microbiological Research. 249: 126784. doi: 10.1016/j.micres.2021.126784. PMID  33989978.
  13. ^ Rawat, Aadish; Roy, Mrinalini; Jyoti, Anupam; Kaushik, Sanket; Verma, Kuldeep; Srivastava, Vijay Kumar (August 2021). "Cysteine proteases: Battling pathogenic parasitic protozoans with omnipresent enzymes". Microbiological Research. 249: 126784. doi: 10.1016/j.micres.2021.126784. PMID  33989978.
  14. ^ Ishino, Y; Shinagawa, H; Makino, K; Amemura, M; Nakata, A (December 1987). "Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product". Journal of Bacteriology. 169 (12): 5429–5433. doi: 10.1128/jb.169.12.5429-5433.1987. ISSN  0021-9193. PMC  213968. PMID  3316184.
  15. ^ van Soolingen, D; de Haas, P E; Hermans, P W; Groenen, P M; van Embden, J D (August 1993). "Comparison of various repetitive DNA elements as genetic markers for strain differentiation and epidemiology of Mycobacterium tuberculosis". Journal of Clinical Microbiology. 31 (8): 1987–1995. doi: 10.1128/jcm.31.8.1987-1995.1993. ISSN  0095-1137. PMC  265684. PMID  7690367.
  16. ^ Groenen, Peter M. A.; Bunschoten, Annelies E.; Soolingen, Dick van; Errtbden, Jan D. A. van (December 1993). "Nature of DNA polymorphism in the direct repeat cluster of Mycobacterium tuberculosis ; application for strain differentiation by a novel typing method". Molecular Microbiology. 10 (5): 1057–1065. doi: 10.1111/j.1365-2958.1993.tb00976.x. ISSN  0950-382X. PMID  7934856.
  17. ^ a b Mojica, Francisco J.M.; Montoliu, Lluis (October 2016). "On the Origin of CRISPR-Cas Technology: From Prokaryotes to Mammals". Trends in Microbiology. 24 (10): 811–820. doi: 10.1016/j.tim.2016.06.005. PMID  27401123.
  18. ^ Mojica, Francisco J.M.; Montoliu, Lluis (October 2016). "On the Origin of CRISPR-Cas Technology: From Prokaryotes to Mammals". Trends in Microbiology. 24 (10): 811–820. doi: 10.1016/j.tim.2016.06.005. PMID  27401123.
  19. ^ a b Mojica, Francisco J. M.; Rodriguez-Valera, Francisco (September 2016). "The discovery of CRISPR in archaea and bacteria". The FEBS Journal. 283 (17): 3162–3169. doi: 10.1111/febs.13766. hdl: 10045/57676. ISSN  1742-464X. PMID  27234458.
  20. ^ Mojica, Francisco J. M.; Díez-Villaseñor, Cesar; Soria, Elena; Juez, Guadalupe (April 2000). "Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria". Molecular Microbiology. 36 (1): 244–246. doi: 10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x. ISSN  0950-382X. PMID  10760181.
  21. ^ Isaacson, Walter (2021). The code breaker: Jennifer Doudna, gene editing, and the future of the human race. New York: Simon & Schuster. ISBN  978-1-9821-1585-2.
  22. ^ Barrangou, Rodolphe; Oost, John van der, eds. (2013). CRISPR-Cas systems: RNA-mediated adaptive immunity in bacteria and archaea. Heidelberg ; New York: Springer. ISBN  978-3-642-34656-9. OCLC  813948020.
  23. ^ Tang, Thean-Hock; Bachellerie, Jean-Pierre; Rozhdestvensky, Timofey; Bortolin, Marie-Line; Huber, Harald; Drungowski, Mario; Elge, Thorsten; Brosius, Jürgen; Hüttenhofer, Alexander (2002-05-28). "Identification of 86 candidates for small non-messenger RNAs from the archaeon Archaeoglobus fulgidus". Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (11): 7536–7541. Bibcode: 2002PNAS...99.7536T. doi: 10.1073/pnas.112047299. ISSN  0027-8424. PMC  124276. PMID  12032318.
  24. ^ Charpentier, Emmanuelle; Richter, Hagen; van der Oost, John; White, Malcolm F. (2015-05-01). "Biogenesis pathways of RNA guides in archaeal and bacterial CRISPR-Cas adaptive immunity". FEMS Microbiology Reviews. 39 (3): 428–441. doi: 10.1093/femsre/fuv023. ISSN  1574-6976. PMID  25994611.
  25. ^ Romero, Dennis A; Magill, Damian; Millen, Anne; Horvath, Philippe; Fremaux, Christophe (2020-11-24). "Dairy lactococcal and streptococcal phage–host interactions: an industrial perspective in an evolving phage landscape". FEMS Microbiology Reviews. 44 (6): 909–932. doi: 10.1093/femsre/fuaa048. ISSN  1574-6976. PMID  33016324.
  26. ^ Romero, Dennis A; Magill, Damian; Millen, Anne; Horvath, Philippe; Fremaux, Christophe (2020-11-24). "Dairy lactococcal and streptococcal phage–host interactions: an industrial perspective in an evolving phage landscape". FEMS Microbiology Reviews. 44 (6): 909–932. doi: 10.1093/femsre/fuaa048. ISSN  1574-6976. PMID  33016324.
  27. ^ Jansen, Ruud.; Embden, Jan. D. A. van; Gaastra, Wim.; Schouls, Leo. M. (March 2002). "Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes". Molecular Microbiology. 43 (6): 1565–1575. doi: 10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x. ISSN  0950-382X. PMID  11952905.
  28. ^ Pourcel, C.; Salvignol, G.; Vergnaud, G. (2005-03-01). "CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies". Microbiology. 151 (3): 653–663. doi: 10.1099/mic.0.27437-0. ISSN  1350-0872. PMID  15758212.
  29. ^ a b Mojica, Francisco J.M.; D�ez-Villase�or, Chc)sar; Garc�a-Mart�nez, Jes�s; Soria, Elena (February 2005). "Intervening Sequences of Regularly Spaced Prokaryotic Repeats Derive from Foreign Genetic Elements". Journal of Molecular Evolution. 60 (2): 174–182. Bibcode: 2005JMolE..60..174M. doi: 10.1007/s00239-004-0046-3. ISSN  0022-2844. PMID  15791728. {{ cite journal}}: replacement character in |first3= at position 4 ( help); replacement character in |last2= at position 2 ( help); replacement character in |last3= at position 5 ( help)
  30. ^ Bolotin, Alexander; Quinquis, Benoit; Sorokin, Alexei; Ehrlich, S. Dusko (2005-08-01). "Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin". Microbiology. 151 (8): 2551–2561. doi: 10.1099/mic.0.28048-0. ISSN  1350-0872. PMID  16079334.
  31. ^ Horvath, Philippe; Barrangou, Rodolphe (2010-01-08). "CRISPR/Cas, the Immune System of Bacteria and Archaea". Science. 327 (5962): 167–170. Bibcode: 2010Sci...327..167H. doi: 10.1126/science.1179555. ISSN  0036-8075. PMID  20056882.
  32. ^ Morange, Michel (June 2015). "What history tells us XXXVII. CRISPR-Cas: The discovery of an immune system in prokaryotes". Journal of Biosciences. 40 (2): 221–223. doi: 10.1007/s12038-015-9532-6. ISSN  0250-5991. PMID  25963251.
  33. ^ Lander, Eric S. (January 2016). "The Heroes of CRISPR". Cell. 164 (1–2): 18–28. doi: 10.1016/j.cell.2015.12.041. PMID  26771483.
  34. ^ Makarova, Kira S; Grishin, Nick V; Shabalina, Svetlana A; Wolf, Yuri I; Koonin, Eugene V (December 2006). "A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action". Biology Direct. 1 (1). doi: 10.1186/1745-6150-1-7. ISSN  1745-6150. PMID  16545108.
  35. ^ Pennisi, Elizabeth (2013-08-23). "The CRISPR Craze". Science. 341 (6148): 833–836. doi: 10.1126/science.341.6148.833. ISSN  0036-8075. PMID  23970676.
  36. ^ a b c Marraffini, Luciano A. (2015-10-01). "CRISPR-Cas immunity in prokaryotes". Nature. 526 (7571): 55–61. Bibcode: 2015Natur.526...55M. doi: 10.1038/nature15386. ISSN  0028-0836. PMID  26432244.
  37. ^ Brouns, Stan J. J.; Jore, Matthijs M.; Lundgren, Magnus; Westra, Edze R.; Slijkhuis, Rik J. H.; Snijders, Ambrosius P. L.; Dickman, Mark J.; Makarova, Kira S.; Koonin, Eugene V.; van der Oost, John (2008-08-15). "Small CRISPR RNAs Guide Antiviral Defense in Prokaryotes". Science. 321 (5891): 960–964. Bibcode: 2008Sci...321..960B. doi: 10.1126/science.1159689. ISSN  0036-8075. PMC  5898235. PMID  18703739.
  38. ^ Garneau, Josiane E.; Dupuis, Marie-Ève; Villion, Manuela; Romero, Dennis A.; Barrangou, Rodolphe; Boyaval, Patrick; Fremaux, Christophe; Horvath, Philippe; Magadán, Alfonso H.; Moineau, Sylvain (2010-11-04). "The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA". Nature. 468 (7320): 67–71. Bibcode: 2010Natur.468...67G. doi: 10.1038/nature09523. ISSN  0028-0836. PMID  21048762.
  39. ^ Deltcheva, Elitza; Chylinski, Krzysztof; Sharma, Cynthia M.; Gonzales, Karine; Chao, Yanjie; Pirzada, Zaid A.; Eckert, Maria R.; Vogel, Jörg; Charpentier, Emmanuelle (March 2011). "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III". Nature. 471 (7340): 602–607. Bibcode: 2011Natur.471..602D. doi: 10.1038/nature09886. ISSN  0028-0836. PMC  3070239. PMID  21455174.
  40. ^ Barrangou, Rodolphe (December 2015). "Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines". Genome Biology. 16 (1): 247. doi: 10.1186/s13059-015-0816-9. ISSN  1474-760X. PMC  4638107. PMID  26549499.
  41. ^ Jinek, Martin; Chylinski, Krzysztof; Fonfara, Ines; Hauer, Michael; Doudna, Jennifer A.; Charpentier, Emmanuelle (2012-08-17). "A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity". Science. 337 (6096): 816–821. Bibcode: 2012Sci...337..816J. doi: 10.1126/science.1225829. ISSN  0036-8075. PMC  6286148. PMID  22745249.
  42. ^ Cong, Le; Ran, F. Ann; Cox, David; Lin, Shuailiang; Barretto, Robert; Habib, Naomi; Hsu, Patrick D.; Wu, Xuebing; Jiang, Wenyan; Marraffini, Luciano A.; Zhang, Feng (2013-02-15). "Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems". Science. 339 (6121): 819–823. Bibcode: 2013Sci...339..819C. doi: 10.1126/science.1231143. ISSN  0036-8075. PMID  23287718.
  43. ^ Mali, Prashant; Yang, Luhan; Esvelt, Kevin M.; Aach, John; Guell, Marc; DiCarlo, James E.; Norville, Julie E.; Church, George M. (2013-02-15). "RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9". Science. 339 (6121): 823–826. Bibcode: 2013Sci...339..823M. doi: 10.1126/science.1232033. ISSN  0036-8075. PMC  3712628. PMID  23287722.
  44. ^ DiCarlo, James E.; Norville, Julie E.; Mali, Prashant; Rios, Xavier; Aach, John; Church, George M. (2013-04-01). "Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems". Nucleic Acids Research. 41 (7): 4336–4343. doi: 10.1093/nar/gkt135. ISSN  1362-4962. PMC  3627607. PMID  23460208.
  45. ^ Zhang, Guo-Chang; Kong, In Iok; Kim, Heejin; Liu, Jing-Jing; Cate, Jamie H. D.; Jin, Yong-Su (2014-12-15). Schottel, J. L. (ed.). "Construction of a Quadruple Auxotrophic Mutant of an Industrial Polyploid Saccharomyces cerevisiae Strain by Using RNA-Guided Cas9 Nuclease". Applied and Environmental Microbiology. 80 (24): 7694–7701. Bibcode: 2014ApEnM..80.7694Z. doi: 10.1128/AEM.02310-14. ISSN  0099-2240. PMC  4249234. PMID  25281382.
  46. ^ Liu, Jing-Jing; Kong, In Iok; Zhang, Guo-Chang; Jayakody, Lahiru N.; Kim, Heejin; Xia, Peng-Fei; Kwak, Suryang; Sung, Bong Hyun; Sohn, Jung-Hoon; Walukiewicz, Hanna E.; Rao, Christopher V.; Jin, Yong-Su (2016-04-15). Brakhage, A. A. (ed.). "Metabolic Engineering of Probiotic Saccharomyces boulardii". Applied and Environmental Microbiology. 82 (8): 2280–2287. Bibcode: 2016ApEnM..82.2280L. doi: 10.1128/AEM.00057-16. ISSN  0099-2240. PMC  4959471. PMID  26850302.
  47. ^ Vyas, Valmik K.; Barrasa, M. Inmaculada; Fink, Gerald R. (2015-04-03). "A Candida albicans CRISPR system permits genetic engineering of essential genes and gene families". Science Advances. 1 (3): e1500248. Bibcode: 2015SciA....1E0248V. doi: 10.1126/sciadv.1500248. ISSN  2375-2548. PMC  4428347. PMID  25977940.
  48. ^ Ng, Henry; Dean, Neta (2017-04-26). Lorenz, Michael (ed.). "Dramatic Improvement of CRISPR/Cas9 Editing in Candida albicans by Increased Single Guide RNA Expression". mSphere. 2 (2). doi: 10.1128/mSphere.00385-16. ISSN  2379-5042. PMC  5397569. PMID  28435892.
  49. ^ Hwang, Woong Y; Fu, Yanfang; Reyon, Deepak; Maeder, Morgan L; Tsai, Shengdar Q; Sander, Jeffry D; Peterson, Randall T; Yeh, J-R Joanna; Joung, J Keith (March 2013). "Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system". Nature Biotechnology. 31 (3): 227–229. doi: 10.1038/nbt.2501. ISSN  1087-0156. PMC  3686313. PMID  23360964.
  50. ^ Gratz, Scott J; Cummings, Alexander M; Nguyen, Jennifer N; Hamm, Danielle C; Donohue, Laura K; Harrison, Melissa M; Wildonger, Jill; O’Connor-Giles, Kate M (2013-08-01). "Genome Engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-Guided Cas9 Nuclease". Genetics. 194 (4): 1029–1035. doi: 10.1534/genetics.113.152710. ISSN  1943-2631. PMC  3730909. PMID  23709638.
  51. ^ Bassett, Andrew R.; Tibbit, Charlotte; Ponting, Chris P.; Liu, Ji-Long (July 2013). "Highly Efficient Targeted Mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 System". Cell Reports. 4 (1): 220–228. doi: 10.1016/j.celrep.2013.06.020. PMC  3714591. PMID  23827738.
  52. ^ Yan, Hua; Opachaloemphan, Comzit; Mancini, Giacomo; Yang, Huan; Gallitto, Matthew; Mlejnek, Jakub; Leibholz, Alexandra; Haight, Kevin; Ghaninia, Majid; Huo, Lucy; Perry, Michael; Slone, Jesse; Zhou, Xiaofan; Traficante, Maria; Penick, Clint A. (August 2017). "An Engineered orco Mutation Produces Aberrant Social Behavior and Defective Neural Development in Ants". Cell. 170 (4): 736–747.e9. doi: 10.1016/j.cell.2017.06.051. PMC  5587193. PMID  28802043.
  53. ^ Trible, Waring; Olivos-Cisneros, Leonora; McKenzie, Sean K.; Saragosti, Jonathan; Chang, Ni-Chen; Matthews, Benjamin J.; Oxley, Peter R.; Kronauer, Daniel J.C. (August 2017). "orco Mutagenesis Causes Loss of Antennal Lobe Glomeruli and Impaired Social Behavior in Ants". Cell. 170 (4): 727–735.e10. doi: 10.1016/j.cell.2017.07.001. PMID  28802042.
  54. ^ Kistler, Kathryn E.; Vosshall, Leslie B.; Matthews, Benjamin J. (April 2015). "Genome Engineering with CRISPR-Cas9 in the Mosquito Aedes aegypti". Cell Reports. 11 (1): 51–60. doi: 10.1016/j.celrep.2015.03.009. PMC  4394034. PMID  25818303.
  55. ^ Friedland, Ari E; Tzur, Yonatan B; Esvelt, Kevin M; Colaiácovo, Monica P; Church, George M; Calarco, John A (August 2013). "Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system". Nature Methods. 10 (8): 741–743. doi: 10.1038/nmeth.2532. ISSN  1548-7091. PMC  3822328. PMID  23817069.
  56. ^ Jiang, Wenzhi; Zhou, Huanbin; Bi, Honghao; Fromm, Michael; Yang, Bing; Weeks, Donald P. (2013-11-01). "Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice". Nucleic Acids Research. 41 (20): e188. doi: 10.1093/nar/gkt780. ISSN  1362-4962. PMC  3814374. PMID  23999092.
  57. ^ Wang, Haoyi; Yang, Hui; Shivalila, Chikdu S.; Dawlaty, Meelad M.; Cheng, Albert W.; Zhang, Feng; Jaenisch, Rudolf (May 2013). "One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering". Cell. 153 (4): 910–918. doi: 10.1016/j.cell.2013.04.025. PMID  23643243.
  58. ^ Soni, Dheeraj; Wang, Dong-Mei; Regmi, Sushil C.; Mittal, Manish; Vogel, Stephen M.; Schlüter, Dirk; Tiruppathi, Chinnaswamy (2018-05-16). "Deubiquitinase function of A20 maintains and repairs endothelial barrier after lung vascular injury". Cell Death Discovery. 4 (1): 60. doi: 10.1038/s41420-018-0056-3. ISSN  2058-7716. PMC  5955943. PMID  29796309.
  59. ^ Guo, Xiangyu; Li, Xiao-Jiang (July 2015). "Targeted genome editing in primate embryos". Cell Research. 25 (7): 767–768. doi: 10.1038/cr.2015.64. ISSN  1001-0602. PMID  26032266.
  60. ^ Baltimore, David; Berg, Paul; Botchan, Michael; Carroll, Dana; Charo, R. Alta; Church, George; Corn, Jacob E.; Daley, George Q.; Doudna, Jennifer A.; Fenner, Marsha; Greely, Henry T.; Jinek, Martin; Martin, G. Steven; Penhoet, Edward; Puck, Jennifer (2015-04-03). "A prudent path forward for genomic engineering and germline gene modification". Science. 348 (6230): 36–38. Bibcode: 2015Sci...348...36B. doi: 10.1126/science.aab1028. ISSN  0036-8075. PMC  4394183. PMID  25791083.
  61. ^ Larson, Matthew H; Gilbert, Luke A; Wang, Xiaowo; Lim, Wendell A; Weissman, Jonathan S; Qi, Lei S (November 2013). "CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression". Nature Protocols. 8 (11): 2180–2196. doi: 10.1038/nprot.2013.132. ISSN  1754-2189. PMC  3922765. PMID  24136345.
  62. ^ Liang, Puping; Xu, Yanwen; Zhang, Xiya; Ding, Chenhui; Huang, Rui; Zhang, Zhen; Lv, Jie; Xie, Xiaowei; Chen, Yuxi; Li, Yujing; Sun, Ying; Bai, Yaofu; Songyang, Zhou; Ma, Wenbin; Zhou, Canquan (May 2015). "CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes". Protein & Cell. 6 (5): 363–372. doi: 10.1007/s13238-015-0153-5. ISSN  1674-800X. PMID  25894090.
  63. ^ Yan, Mei-Yi; Yan, Hai-Qin; Ren, Gai-Xian; Zhao, Ju-Ping; Guo, Xiao-Peng; Sun, Yi-Cheng (September 2017). Müller, Volker (ed.). "CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria". Applied and Environmental Microbiology. 83 (17). Bibcode: 2017ApEnM..83E.947Y. doi: 10.1128/AEM.00947-17. ISSN  0099-2240. PMC  5561284. PMID  28646112.
  64. ^ Zetsche, Bernd; Gootenberg, Jonathan S.; Abudayyeh, Omar O.; Slaymaker, Ian M.; Makarova, Kira S.; Essletzbichler, Patrick; Volz, Sara E.; Joung, Julia; van der Oost, John; Regev, Aviv; Koonin, Eugene V.; Zhang, Feng (October 2015). "Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System". Cell. 163 (3): 759–771. doi: 10.1016/j.cell.2015.09.038. PMID  26422227.
  65. ^ Fonfara, Ines; Richter, Hagen; Bratovič, Majda; Le Rhun, Anaïs; Charpentier, Emmanuelle (April 2016). "The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA". Nature. 532 (7600): 517–521. Bibcode: 2016Natur.532..517F. doi: 10.1038/nature17945. ISSN  0028-0836. PMID  27096362.
  66. ^ Kim, Hyeran; Kim, Sang-Tae; Ryu, Jahee; Kang, Beum-Chang; Kim, Jin-Soo; Kim, Sang-Gyu (2017-02-16). "CRISPR/Cpf1-mediated DNA-free plant genome editing". Nature Communications. 8 (1): 14406. Bibcode: 2017NatCo...814406K. doi: 10.1038/ncomms14406. ISSN  2041-1723. PMC  5316869. PMID  28205546.
  67. ^ Miao, Chensi; Zhao, Huiwei; Qian, Long; Lou, Chunbo (2018-04-09). "Systematically investigating the key features of the nuclease deactivated Cpf1 for tunable multiplex genetic regulation". dx.doi.org. doi: 10.1101/297903. Retrieved 2024-05-03.
  68. ^ Chen, Janice S.; Ma, Enbo; Harrington, Lucas B.; Da Costa, Maria; Tian, Xinran; Palefsky, Joel M.; Doudna, Jennifer A. (2018-04-27). "CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity". Science. 360 (6387): 436–439. Bibcode: 2018Sci...360..436C. doi: 10.1126/science.aar6245. ISSN  0036-8075. PMID  29449511.
  69. ^ Broughton, James P.; Deng, Xianding; Yu, Guixia; Fasching, Clare L.; Servellita, Venice; Singh, Jasmeet; Miao, Xin; Streithorst, Jessica A.; Granados, Andrea; Sotomayor-Gonzalez, Alicia; Zorn, Kelsey; Gopez, Allan; Hsu, Elaine; Gu, Wei; Miller, Steve (July 2020). "CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2". Nature Biotechnology. 38 (7): 870–874. doi: 10.1038/s41587-020-0513-4. ISSN  1087-0156. PMC  9107629. PMID  32300245.
  70. ^ Nguyen, Long T.; Smith, Brianna M.; Jain, Piyush K. (2020-09-30). "Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection". Nature Communications. 11 (1): 4906. Bibcode: 2020NatCo..11.4906N. doi: 10.1038/s41467-020-18615-1. ISSN  2041-1723.
  71. ^ Abudayyeh, Omar O.; Gootenberg, Jonathan S.; Konermann, Silvana; Joung, Julia; Slaymaker, Ian M.; Cox, David B. T.; Shmakov, Sergey; Makarova, Kira S.; Semenova, Ekaterina; Minakhin, Leonid; Severinov, Konstantin; Regev, Aviv; Lander, Eric S.; Koonin, Eugene V.; Zhang, Feng (2016-08-05). "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector". Science. 353 (6299). doi: 10.1126/science.aaf5573. ISSN  0036-8075. PMID  27256883.
  72. ^ Gootenberg, Jonathan S.; Abudayyeh, Omar O.; Lee, Jeong Wook; Essletzbichler, Patrick; Dy, Aaron J.; Joung, Julia; Verdine, Vanessa; Donghia, Nina; Daringer, Nichole M.; Freije, Catherine A.; Myhrvold, Cameron; Bhattacharyya, Roby P.; Livny, Jonathan; Regev, Aviv; Koonin, Eugene V. (2017-04-28). "Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2". Science. 356 (6336): 438–442. Bibcode: 2017Sci...356..438G. doi: 10.1126/science.aam9321. ISSN  0036-8075. PMC  5526198. PMID  28408723.
  73. ^ Gootenberg, Jonathan S.; Abudayyeh, Omar O.; Kellner, Max J.; Joung, Julia; Collins, James J.; Zhang, Feng (2018-04-27). "Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6". Science. 360 (6387): 439–444. Bibcode: 2018Sci...360..439G. doi: 10.1126/science.aaq0179. ISSN  0036-8075. PMC  5961727. PMID  29449508.
  74. ^ Iwasaki, Roman S; Batey, Robert T (2020-09-25). "SPRINT: a Cas13a-based platform for detection of small molecules". Nucleic Acids Research. 48 (17): e101. doi: 10.1093/nar/gkaa673. ISSN  0305-1048. PMID  32797156.
  75. ^ Mahas, Ahmed; Wang, Qiaochu; Marsic, Tin; Mahfouz, Magdy M. (2021-10-15). "A Novel Miniature CRISPR-Cas13 System for SARS-CoV-2 Diagnostics". ACS Synthetic Biology. 10 (10): 2541–2551. doi: 10.1021/acssynbio.1c00181. ISSN  2161-5063.
  76. ^ Hille, Frank; Charpentier, Emmanuelle (2016-11-05). "CRISPR-Cas: biology, mechanisms and relevance". Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1707): 20150496. doi: 10.1098/rstb.2015.0496. ISSN  0962-8436. PMC  5052741. PMID  27672148.
  77. ^ a b c Barrangou, Rodolphe; Marraffini, Luciano A. (April 2014). "CRISPR-Cas Systems: Prokaryotes Upgrade to Adaptive Immunity". Molecular Cell. 54 (2): 234–244. doi: 10.1016/j.molcel.2014.03.011. PMID  24766887.
  78. ^ Tyson, Gene W.; Banfield, Jillian F. (January 2008). "Rapidly evolving CRISPRs implicated in acquired resistance of microorganisms to viruses". Environmental Microbiology. 10 (1): 200–207. Bibcode: 2008EnvMi..10..200T. doi: 10.1111/j.1462-2920.2007.01444.x. ISSN  1462-2912. PMID  17894817.
  79. ^ a b Koonin, Eugene V.; Makarova, Kira S. (2019-05-13). "Origins and evolution of CRISPR-Cas systems". Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 374 (1772): 20180087. doi: 10.1098/rstb.2018.0087. ISSN  0962-8436. PMID  30905284.
  80. ^ Wright, Addison V.; Nuñez, James K.; Doudna, Jennifer A. (January 2016). "Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering". Cell. 164 (1–2): 29–44. doi: 10.1016/j.cell.2015.12.035. PMID  26771484.
  81. ^ Westra, Edze R.; Dowling, Andrea J.; Broniewski, Jenny M.; van Houte, Stineke (2016-11-01). "Evolution and Ecology of CRISPR". Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 47 (1): 307–331. doi: 10.1146/annurev-ecolsys-121415-032428. ISSN  1543-592X.
  82. ^ Makarova, Kira S.; Wolf, Yuri I.; Alkhnbashi, Omer S.; Costa, Fabrizio; Shah, Shiraz A.; Saunders, Sita J.; Barrangou, Rodolphe; Brouns, Stan J. J.; Charpentier, Emmanuelle; Haft, Daniel H.; Horvath, Philippe; Moineau, Sylvain; Mojica, Francisco J. M.; Terns, Rebecca M.; Terns, Michael P. (November 2015). "An updated evolutionary classification of CRISPR–Cas systems". Nature Reviews Microbiology. 13 (11): 722–736. doi: 10.1038/nrmicro3569. ISSN  1740-1526. PMC  5426118. PMID  26411297.
  83. ^ a b Wiedenheft, Blake; Sternberg, Samuel H.; Doudna, Jennifer A. (February 2012). "RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea". Nature. 482 (7385): 331–338. Bibcode: 2012Natur.482..331W. doi: 10.1038/nature10886. ISSN  0028-0836. PMID  22337052.
  84. ^ Deng, Ling; Garrett, Roger A.; Shah, Shiraz A.; Peng, Xu; She, Qunxin (March 2013). "A novel interference mechanism by a type IIIB CRISPR - Cmr module in S ulfolobus". Molecular Microbiology. 87 (5): 1088–1099. doi: 10.1111/mmi.12152. ISSN  0950-382X. PMID  23320564.
  85. ^ Azangou-Khyavy, Mohammadreza; Ghasemi, Mobina; Khanali, Javad; Boroomand-Saboor, Melika; Jamalkhah, Monire; Soleimani, Masoud; Kiani, Jafar (2020-09-29). "CRISPR/Cas: From Tumor Gene Editing to T Cell-Based Immunotherapy of Cancer". Frontiers in Immunology. 11. doi: 10.3389/fimmu.2020.02062. ISSN  1664-3224. PMID  33117331.
  86. ^ Aliyari, Roghiyh; Ding, Shou-Wei (January 2009). "RNA-based viral immunity initiated by the Dicer family of host immune receptors". Immunological Reviews. 227 (1): 176–188. doi: 10.1111/j.1600-065X.2008.00722.x. ISSN  0105-2896. PMC  2676720. PMID  19120484.
  87. ^ Dugar, Gaurav; Herbig, Alexander; Förstner, Konrad U.; Heidrich, Nadja; Reinhardt, Richard; Nieselt, Kay; Sharma, Cynthia M. (2013-05-16). Hughes, Diarmaid (ed.). "High-Resolution Transcriptome Maps Reveal Strain-Specific Regulatory Features of Multiple Campylobacter jejuni Isolates". PLOS Genetics. 9 (5): e1003495. doi: 10.1371/journal.pgen.1003495. ISSN  1553-7404. PMID  23696746.
  88. ^ Hatoum-Aslan, Asma; Maniv, Inbal; Marraffini, Luciano A. (2011-12-27). "Mature clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats RNA (crRNA) length is measured by a ruler mechanism anchored at the precursor processing site". Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52): 21218–21222. Bibcode: 2011PNAS..10821218H. doi: 10.1073/pnas.1112832108. ISSN  0027-8424. PMC  3248500. PMID  22160698.
  89. ^ Yosef, Ido; Goren, Moran G.; Qimron, Udi (2012-07-01). "Proteins and DNA elements essential for the CRISPR adaptation process in Escherichia coli". Nucleic Acids Research. 40 (12): 5569–5576. doi: 10.1093/nar/gks216. ISSN  1362-4962. PMID  22402487.
  90. ^ Swarts, Daan C.; Mosterd, Cas; van Passel, Mark W. J.; Brouns, Stan J. J. (2012-04-27). Mokrousov, Igor (ed.). "CRISPR Interference Directs Strand Specific Spacer Acquisition". PLOS ONE. 7 (4): e35888. Bibcode: 2012PLoSO...735888S. doi: 10.1371/journal.pone.0035888. ISSN  1932-6203. PMC  3338789. PMID  22558257.
  91. ^ Babu, Mohan; Beloglazova, Natalia; Flick, Robert; Graham, Chris; Skarina, Tatiana; Nocek, Boguslaw; Gagarinova, Alla; Pogoutse, Oxana; Brown, Greg; Binkowski, Andrew; Phanse, Sadhna; Joachimiak, Andrzej; Koonin, Eugene V.; Savchenko, Alexei; Emili, Andrew (January 2011). "A dual function of the CRISPR–Cas system in bacterial antivirus immunity and DNA repair". Molecular Microbiology. 79 (2): 484–502. doi: 10.1111/j.1365-2958.2010.07465.x. ISSN  0950-382X. PMID  21219465.
  92. ^ Han, Dong; Lehmann, Kathleen; Krauss, Gerhard (2009-06-18). "SSO1450 – A CAS1 protein from Sulfolobus solfataricus P2 with high affinity for RNA and DNA". FEBS Letters. 583 (12): 1928–1932. Bibcode: 2009FEBSL.583.1928H. doi: 10.1016/j.febslet.2009.04.047. ISSN  0014-5793. PMID  19427858.
  93. ^ Wiedenheft, Blake; Zhou, Kaihong; Jinek, Martin; Coyle, Scott M.; Ma, Wendy; Doudna, Jennifer A. (June 2009). "Structural Basis for DNase Activity of a Conserved Protein Implicated in CRISPR-Mediated Genome Defense". Structure. 17 (6): 904–912. doi: 10.1016/j.str.2009.03.019.
  94. ^ Beloglazova, Natalia; Brown, Greg; Zimmerman, Matthew D.; Proudfoot, Michael; Makarova, Kira S.; Kudritska, Marina; Kochinyan, Samvel; Wang, Shuren; Chruszcz, Maksymilian; Minor, Wladek; Koonin, Eugene V.; Edwards, Aled M.; Savchenko, Alexei; Yakunin, Alexander F. (July 2008). "A Novel Family of Sequence-specific Endoribonucleases Associated with the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats". Journal of Biological Chemistry. 283 (29): 20361–20371. doi: 10.1074/jbc.M803225200. PMC  2459268. PMID  18482976.
  95. ^ Samai, Poulami; Smith, Paul; Shuman, Stewart (2010-12-01). "Structure of a CRISPR-associated protein Cas2 from Desulfovibrio vulgaris". Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 66 (12): 1552–1556. doi: 10.1107/S1744309110039801. ISSN  1744-3091. PMC  2998353. PMID  21139194.
  96. ^ Nam, Ki Hyun; Ding, Fran; Haitjema, Charles; Huang, Qingqiu; DeLisa, Matthew P.; Ke, Ailong (October 2012). "Double-stranded Endonuclease Activity in Bacillus halodurans Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated Cas2 Protein". Journal of Biological Chemistry. 287 (43): 35943–35952. doi: 10.1074/jbc.M112.382598. PMID  22942283.
  97. ^ a b Nuñez, James K; Kranzusch, Philip J; Noeske, Jonas; Wright, Addison V; Davies, Christopher W; Doudna, Jennifer A (June 2014). "Cas1–Cas2 complex formation mediates spacer acquisition during CRISPR–Cas adaptive immunity". Nature Structural & Molecular Biology. 21 (6): 528–534. doi: 10.1038/nsmb.2820. ISSN  1545-9993. PMC  4075942. PMID  24793649.
  98. ^ Nuñez, James K.; Lee, Amy S. Y.; Engelman, Alan; Doudna, Jennifer A. (2015-03-12). "Integrase-mediated spacer acquisition during CRISPR–Cas adaptive immunity". Nature. 519 (7542): 193–198. Bibcode: 2015Natur.519..193N. doi: 10.1038/nature14237. ISSN  0028-0836. PMC  4359072. PMID  25707795.
  99. ^ Wang, Jiuyu; Li, Jiazhi; Zhao, Hongtu; Sheng, Gang; Wang, Min; Yin, Maolu; Wang, Yanli (November 2015). "Structural and Mechanistic Basis of PAM-Dependent Spacer Acquisition in CRISPR-Cas Systems". Cell. 163 (4): 840–853. doi: 10.1016/j.cell.2015.10.008. PMID  26478180.
  100. ^ Nuñez, James K.; Harrington, Lucas B.; Kranzusch, Philip J.; Engelman, Alan N.; Doudna, Jennifer A. (November 2015). "Foreign DNA capture during CRISPR–Cas adaptive immunity". Nature. 527 (7579): 535–538. Bibcode: 2015Natur.527..535N. doi: 10.1038/nature15760. ISSN  0028-0836. PMC  4662619. PMID  26503043.
  101. ^ Sorek, Rotem; Lawrence, C. Martin; Wiedenheft, Blake (2013-06-02). "CRISPR-Mediated Adaptive Immune Systems in Bacteria and Archaea". Annual Review of Biochemistry. 82 (1): 237–266. doi: 10.1146/annurev-biochem-072911-172315. ISSN  0066-4154.
  102. ^ Nuñez, James K.; Bai, Lawrence; Harrington, Lucas B.; Hinder, Tracey L.; Doudna, Jennifer A. (June 2016). "CRISPR Immunological Memory Requires a Host Factor for Specificity". Molecular Cell. 62 (6): 824–833. doi: 10.1016/j.molcel.2016.04.027. PMID  27211867.
  103. ^ Fagerlund, Robert D.; Wilkinson, Max E.; Klykov, Oleg; Barendregt, Arjan; Pearce, F. Grant; Kieper, Sebastian N.; Maxwell, Howard W. R.; Capolupo, Angela; Heck, Albert J. R.; Krause, Kurt L.; Bostina, Mihnea; Scheltema, Richard A.; Staals, Raymond H. J.; Fineran, Peter C. (2017-06-27). "Spacer capture and integration by a type I-F Cas1–Cas2-3 CRISPR adaptation complex". Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (26). Bibcode: 2017PNAS..114E5122F. doi: 10.1073/pnas.1618421114. ISSN  0027-8424.
  104. ^ Rollie, Clare; Graham, Shirley; Rouillon, Christophe; White, Malcolm F (2018-02-16). "Prespacer processing and specific integration in a Type I-A CRISPR system". Nucleic Acids Research. 46 (3): 1007–1020. doi: 10.1093/nar/gkx1232. ISSN  0305-1048. PMC  5815122. PMID  29228332.
Retrieved from " https://en.wikipedia.org/?title=User:AnastasiaKaratza/sandbox&oldid=1222618252"